En tiempos de la Reconquista aparece el nombre de Dos Hermanas. El Rey Fernando III acampó en la Torre de los Hebreros y más tarde en la zona de Cuarto. En este lugar ocurrió el célebre "milagro de la Virgen" que ayudó al Rey en una batalla, en la que, gritando, rogó "Val (e) me, señora, val (e) me", hecho que dio lugar a la construcción de la Ermita de Valme, donde se venera a la Virgen del mismo nombre.
El origen del actual asentamiento es el reparto de tierras que se hizo tras la conquista de Sevilla por el rey castellano Fernando III (23 de noviembre de 1248). Su hijo Alfonso X el Sabio repartió las tierras conquistadas entre los caballeros que habían participado en ella.
Dos hermanas, Elvira y Estefanía Nazareno, probablemente hermanas a su vez de Gonzalo Nazareno.
Cuenta la leyenda que, guiadas por el sonido de una campana, encontraron una imagen gótica triplex representando a Santa Ana, María y Jesús. Alrededor de la gruta construyeron una iglesia, que junto a los cortijos adyacentes constituirían el germen de la actual ciudad, que serian escondidas por los cristianos para que no cayeran en manos de los moros.

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